3D打印支架载神经分化因子1修饰的神经干
2017-6-23 来源：不详 浏览次数：次脊髓损伤是指因暴力导致脊柱损伤而引起脊髓损伤的疾病，是脊柱损伤最严重的并发症，导致损伤平面以下肢体出现严重的感觉和运动功能障碍。每年全球每百万人中就有3.6～人发生脊髓损伤，如何提高脊髓损伤的治疗效果已成为当今医学界的一大课题。大量基础实验研究证实组织工程学在脊髓损伤治疗中有着广阔的应用前景。组织工程学治疗脊髓损伤的基本思路是生物支架＋种子细胞：将携带目的细胞的支架原位移植于脊髓损伤处，提供通路和细胞库以期达到促进轴突再生重塑传导束的目的。笔者运用3D打印机制备仿生脊髓生物支架，构建神经分化因子1(NeuroD1)过表达神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)，应用撞击仪建立大鼠脊髓损伤模型，探讨3D仿生支架载NeuroD1修饰的NSCs对大鼠脊髓损伤修复的疗效。
1 材料与方法
1.1 仪器和材料
材料包括硫酸肝素、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白(美国Sigma公司)，B27、成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)(美国Invitrogen公司)，巢蛋白(NSCs标记物)、微管相关蛋白2(MAP2，神经元标记物)一抗及荧光标记二抗(英国Abcam公司)，携带绿色荧光蛋白(GFP)基因和同时携带GFP和NeuroD1基因的反转录病毒(上海和元生物科技有限公司)，QPCR试剂盒(北京全氏金公司)。仪器包括3D生物打印机(Regenovo，杭州捷诺飞生物科技有限公司)，FEIQUANTA扫描电镜(荷兰飞纳公司)，倒置荧光显微镜DWIB(德国LEICA公司)，可控性皮质损伤撞击仪(mode－6.3，美国CustomDesign公司)，手术显微镜(镇江中天光学仪器有限责任公司)，手术器械(上海医疗器械有限公司手术器械厂)，微型磨钻(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，诱发电位仪(VIKINGQUEST，美国尼高力公司)。
1.2 NeuroD1过表达NSCs的构建和鉴定
取培养第三代的NSCs，消化后置15ml离心管中，r/min离心5min，去上清，加入适量新鲜培养基，以1×/ml密度接种于24孔板中，加入μl细胞培养基。实验分为三组：对照组(NSCs组，加入等量培养基)、NSCs－GFP组和NSCs－NeuroD1组[按照病毒感染复数(MOI)＝1∶10分别加入携带GFP基因和同时携带GFP和NeuroD1基因的反转录病毒，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育12h后离心弃去转染液，加入新鲜培养基]。然后每隔24h在激光共聚焦显微镜下观测GFP的表达情况。转染后7d，收集各组细胞，提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度。按反转录体系将总RNA反转录成cDNA，用实时定量RT－PCR法检测各组NeuroD1mRNA水平。
1.3 支架细胞预处理
按实验室先前方法制作3D打印仿生脊髓支架，将其处理为长2～3mm的截断，置于干细胞培养基中浸泡48h后，在无菌操作台中风干，灭菌备用。将NSCs－GFP和NSCs－NeuroD1细胞培养至第7天时，消化计数，将1×个细胞浓缩为0.2ml，滴于预处理过的支架上，置于培养箱中2h后用于实验。
1.4 实验设计及分组
健康8周龄雌性SD大鼠40只，体重～g，由军事医学科学院实验动物中心提供[动物许可证号：SYXK－(军)－]，通过军事医学科学院动物伦理委员会要求。按照随机数字表法分为四组，每组10只。40只SD大鼠均按实验室先前方法用可控性皮质撞击仪构建脊髓损伤模型。常规护理，于1周后进行实验。麻醉后，切片，磨钻及镊子去除椎板，四组均切除2～3mm长损伤处脊髓，给予不同干预措施。A组为对照组(不再给予其他处理，止血消毒后逐层缝合)；B组为支架组(2～3mm仿生支架置于损伤处)；C组为支架＋NSCs－GFP组(荷载NSCs的2～3mm支架置于损伤处)；D组为支架＋NSCs－NeuroD1组(荷载NSCs－NeuroD1的2～3mm支架置于损伤处)。
1.5 功能学评估
BBB评分，即开放领域运动测试。将大鼠置于一个长径1.5m、短径0.6m的椭圆形运动区域，观察大鼠运动2min，根据BBB评分量表对大鼠的后肢运动情况进行评分，评分为0～21分，于1，2，4，6，8周分别进行评分。美国尼高力诱发电位仪测定四组大鼠的运动和感觉诱发电位。
1.6 形态学评估
于实验的第8周取材，荧光显微镜下观察移植NSCs存活情况。神经核(Neun)和生长相关蛋白－43(GAP－43)荧光染色鉴定移植NSCs分化和髓鞘形成情况。
1.7 统计学分析
应用GraphPadPrism5.0统计软件，计量资料以±s表示，比较时采用带有SNK的单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NeuroD1过表达NSCs的鉴定
2.1.1 GFP转染鉴定：
NSCs转染后第3天，荧光显微镜下观察可见单细胞发绿光，颜色较淡；第5天，单细胞增殖分裂形成小的细胞集落；第7天，可见大的神经球形成，悬浮生长，整个神经球都发绿光。见图1。
图1
荧光显微镜下观察NSCs转染情况(×)。 A、B.转染第3天，部分NSCs已发出绿光，表明GFP转染成功； C、D.转染第5天，NSCs开始增殖形成细胞集落，新生NSCs也发绿光，表明GFP可稳定表达； E、F.转染第7天，NSCs增殖形成神经球，可见整个神经球都发绿光，与光镜下细胞完全重合，转染率接近%。注：NSCs为神经干细胞，GFP为绿色荧光蛋白
2.1.2 NeuroD1转染鉴定：
B组、C组和D组的mRNA相对表达量分别为1.00±0.00，0.97±0.02和1.70±0.10。结果显示，D组NeuroD1mRNA含量明显提高，与其他两组比较差异有统计学意义(F＝78.25，P0.05)。见图2。
图2
RT－PCR检测三组NeuroD1mRNA含量。注：与B、C组比较：aP0.05。NeuroD1为神经分化因子1，NSCs为神经干细胞，GFP为绿色萤光蛋白；B组为支架组，C组为支架＋NSCs－GFP组，D组为支架＋NSCs－NeuroD1组
2.2 功能评估
2.2.1 BBB评分：
BBB评分结果显示造模后1周，BBB评分均为0分，这可能与机体应激状态和细胞增殖分化需要一定的时间有关。第2周，D组评分高于其他三组(P0.05)；第4周，四组之间差异均有统计学意义(P0.05)，其中D组评分最高；第6周，D组评分依旧最高，与其他三组差异有统计学意义(P0.05)，C组、D组与A组比较差异有统计学意义(P0.05)，C组和D组差异有统计学意义(P0.05)；第8周，D组评分依旧最高，与其他三组差异有统计学意义(P0.05)，C组、D组与A组差异有统计学意义(P0.05)，C组和D组差异有统计学意义(P0.05)。见表1。
表1
四组在不同时相点BBB评分比较(分，±s)
2.2.2 神经电生理：
在运动潜伏期中，D组最短，与其他三组比较差异有统计学意义(P0.05)；在运动振幅中，C组与A组和B组差异有统计学意义(P0.05)，D组与其他三组差异有统计学意义(P0.05)，其中D组振幅最大。在感觉潜伏期中，除了B组和C组差异无统计学意义(P0.05)，其余各组之间差异均有统计学意义(P0.05)，其中D组潜伏期最短；在感觉振幅中，除了B组和C组差异无统计学意义，其余各组之间差异均有统计学意义(P0.05)。见表2。
表2
四组在第8周时神经电生理评分比较(±s)
2.3 形态学评估
8周时取材，可见D组在荧光显微镜下，GFP仍发绿光，与细胞核共标。移植细胞伸出大量突起(图3)。行Neun免疫荧光染色，可见与GFP荧光共标，移植细胞大量分化为神经元，而在其他三组中只能见到零星的神经元细胞(图4)。而GAP－43免疫荧光染色，与细胞核共标，神经髓鞘形成(图5)。
图3
D组可见大量移植的存活和分化的NSCs(免疫荧光染色×)。A.细胞核；B.GFP代表移植的NSCs，仍发出绿光，并且已有形态变化，伸出大量突起；C.拟合和局部放大图像
图4
D组中可见移植NSCs分化为神经元(免疫荧光染色×)。A.细胞核；B.GFP代表移植的NSCs；C.Neun为神经元特异蛋白，表明移植的NSCs已分化为神经元；D.拟合图像
图5
D组中可见移植的NSCs形成髓鞘(免疫荧光染色×)。A.细胞核；B.GAP－43；C.拟合图像。注：D组为支架＋NSCs－NeuroD1组；NeuroD1为神经分化因子1，NSCs为神经干细胞，GFP为绿色荧光蛋白，Neun为神经核，GAP－43为生长相关蛋白－43
3 讨论
脊髓损伤后局部胶质瘢痕形成，上下行神经传导束中断，大量神经细胞在抑制性的化学和物理微环境下死亡，这是当前临床治疗效果欠佳的重要原因。如何克服局部屏障达到促进神经元轴突再生、神经环路重建成为治疗的关键。组织工程学为脊髓损伤治疗提供了新的思路，并且取得了众多研究成果。生物相容性良好的支架和理想的种子细胞是其发挥作用的基础。本实验中创新性地将3D打印技术应用于支架的制备，同时将基因技术应用于种子细胞的修饰，结果表明，两者结合能明显促进脊髓损伤大鼠的运动和感觉功能恢复。BBB评分中，支架＋NSCs－NeuroD1组在各时相点评分均最高，BBB评分越高说明大鼠的后肢运动功能恢复得越好。神经电生理检测中，支架＋NSCs－NeuroD1组运动和感觉诱发电位的潜伏期最短、振幅最大。潜伏期越短、振幅越大说明大鼠的脊髓传导功能越好。脊髓切片发现支架＋NSCs－NeuroD1组中大量存活的移植NSCs，并且分化为神经元。而在支架＋NSCs－NeuroD1组中可见GAP－43阳性，而GAP－43与神经髓鞘形成有关，表明移植的NSCs之间或与宿主之间已形成了神经联络。
传统的支架多采用低温成型和模型注塑，步骤繁琐，精度难以把握，支架性能差异很大，也不能随意改变支架的走向和孔隙。3D打印技术的出现为解决上述问题提供了可能。3D打印机能按照预设的模型精准打印，具有成型迅速、样品标准、规模量产等优点，并且可通过改变各种参数打印出不同规模的支架。笔者先前采用3D生物打印机制备出胶原蛋白－硫酸肝素仿生脊髓支架，体外与NSCs共培养，生物相容性良好。在本研究中，支架组和支架＋细胞组均能促进脊髓损伤后功能的恢复，尤其是支架＋细胞组。3D支架为中空多孔结构，为轴突的生长和上下行传导束重建提供了通道，去除了物理隔绝，改善了局部抑制性的物理微环境；同时移植的NSCs一方面发挥其细胞替换作用，在损伤处大量增殖分化，从而达到替代局部损伤组织的作用，另一方面通过分泌众多促进神经修复的因子，改善了局部抑制性的化学微环境。
NSCs具有多样分化潜能，是理想的种子细胞，然而众多研究表明，移植的NSCs多分化为胶质细胞，低神经元分化率制约了其效果，而基因技术的出现为解决上述问题提供了可能。研究表明，过表达NeuroD1可将外胚层所有类型的细胞转化为完全分化的神经元。NeuroD1基因敲除的小鼠出现神经系统的某些细胞死亡，可导致小脑、海马结构及内耳感觉神经节细胞的缺失，产生共济失调、耳聋等神经系统方面的功能障碍。Guo等通过基因技术将NeuroD1基因导入反应性胶质细胞中，反应性胶质细胞可表达神经元的特异性蛋白，并可检测到神经电活动。研究表明，NeuroD1基因缺陷大鼠，其大脑内神经元细胞大量死亡，这与Bax介导的坏死性凋亡通路有关。本实验室前期将携带NeuroD1的反转录病毒转染NSCs，构建NeuroD1过表达NSCs系，发现NeuroD1过表达可促使NSCs向神经元方向分化。而本实验结果中支架＋NSCs－NeuroD1组大鼠功能恢复明显好于支架＋NSCs－GFP组，表明在NeuroD1的作用下，移植的NSCs更多地向神经元方向分化，新生神经元之间或与机体残留的正常神经细胞之前形成突触联系从而发挥治疗作用。
综上所述，3D打印支架载NeuroD1修饰的NSCs能促进脊髓损伤大鼠神经环路的重建，对运动和感觉功能恢复有促进作用。将3D打印技术和基因技术运用于组织工程学是治疗脊髓损伤非常有前景的方法。
产品名：创面护理功能性敷料（商品名：立见护创液）
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质量标准：淡黄色澄清透明液体，PH：5.4~6.0
产品注册证号：渝食药监械（准）字第号
适应症：各类外科、内分泌、烧烫伤、皮肤科等凡是与皮肤损伤有关的科室。也可以作为家庭药箱常备品。适用于创面的各个分期。
