间质干细胞在椎间盘再生中的潜在性应用

本文原载于《中华骨科杂志》年第16期

一、IDD与治疗策略

椎间盘连接相邻椎体，是由上下终板、中央髓核及外周纤维环组成的凝胶状结构，其作用是促进脊柱旋转及屈伸时力学负荷的承载与传导，保持终板内应力的均匀分布，充当脊柱压缩载荷的减震垫（图2）。除外周纤维环外1/3有少量血液供应外，其余椎间盘组织无神经和血供支配，只依赖终板的渗透作用获取营养物质[4]。中央髓核是由ECM、软骨样细胞和水（正常含水量为80%~88%）构成的水合凝胶状结构。软骨样细胞通过ECM中的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、弹性蛋白纤维及成软骨转录因子SOX9发挥主要作用[5]。中央髓核长期承受机械性高压并处在高乳酸浓度和静压力的低氧环境中[6]，逃避细胞及体液免疫，是主要的"免疫豁免"组织[7]。研究显示，一定作用时间和强度的静水压刺激可以促进BM-MSCs向成骨分化，但较长期的作用可能会促进成脂分化[8]。

图2人体椎间盘组织结构示意图，椎间盘连接相邻椎体，是由上下终板、中央髓核及外周纤维环组成的凝胶状结构，其作用是促进脊柱旋转及屈伸时力学负荷的承载与传导，保持终板内应力的均匀分布，充当脊柱压缩载荷的减震垫

外周纤维环主要由15~25层同心胶原纤维环（主要为Ⅰ型胶原）层状相互平行排列而成[9]。终板由0.6mm厚的无血管透明软骨和纤维软骨构成，牢固地附着在外周纤维环的胶原纤维上，其主要成分类似于中央髓核，但蛋白聚糖和含水量较少，胶原含量比中央髓核相邻区域高。

椎间盘正常老化、外伤、生物力学、遗传等因素会使其结构发生改变，造成水合ECM减少，蛋白聚糖及复合蛋白丢失，引起中央髓核内水合降低，微环境代谢失衡，导致IDD并引发腰痛、坐骨神经痛等一系列症状[10]。炎症介质、细胞因子、趋化因子及遗传变异等均在IDD过程中起重要作用[11]。尽管椎间盘再生能力有限，但从IDD分离的活细胞在体外则可表现出增殖和分化的能力[12,13]。研究报道，IDD中衍生的变形活细胞可弥补衰老和凋亡细胞的数量[14]。

目前，主要根据腰痛性质对IDD进行治疗性干预（推拿按摩、针灸、药物等非手术和手术治疗）。然而，约20％的腰痛会逐渐变为慢性（超过3个月），其中约5％的慢性腰痛将会选择手术治疗[3]。手术治疗以髓核摘除、脊柱融合及微创椎间盘置换术为主，在有限范围内模仿正常椎间盘来支撑脊柱的自然运动，目的是缓解腰痛[12]。然而，通过生物材料保留现有脊柱节段并维持其功能的治疗仍不能有效修复退变椎间盘组织。

近年来，随着MSCs和再生医学的发展，以MSCs为基础的治疗策略逐渐成为治疗IDD的潜在手段，并得到体内外实验和临床初步研究证实[15,16,17]。但MSCs表型与中央髓核细胞表型是否相一致、体外MSCs分化后还是未分化状态下移植、MSCs是否向软骨细胞有效分化、椎间盘内是否有干细胞、MSCs的作用机制、目前MSCs在修复退变椎间盘的研究中存在的主要挑战是什么，本文将对以上问题进行讨论并综述。

二、MSCs及其再生潜能

（一）MSCs表型

MSCs是具有自我更新能力、多向分化潜能和免疫调节的成体干细胞[7]。目前，研究发现许多组织中存在MSCs[18]，包括嗅黏膜、椎间盘、滑膜、骨骼肌、脂肪组织、骨髓和胚胎组织（图3）。骨髓干细胞是成人MSCs经历广泛研究和临床试验的主要种子细胞[19]。MSCs可以表达CD73、CD90和CD，但缺乏表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19和HLA-DR等主要谱系标记物，与椎间盘骨祖细胞分化的谱系标记物相类似[3,13]，诱导MSCs分化成特殊的多谱系细胞，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。最近，中央髓核细胞及MSCs表型、特定标志物的研究发现，MSCs分化为中央髓核细胞的主要依据是正常中央髓核细胞的标志物[20]。虽然关于MSCs可塑性方面的研究仍存在争议[21]，但在适当条件下MSCs不仅能定向分化，还可分化成非胚层谱系细胞，如神经元细胞[18]和产生胰岛素的β细胞[22]。

图3许多组织中存在MSCs，包括嗅黏膜、椎间盘、滑膜、骨骼肌、脂肪组织、骨髓和胚胎组织

（二）MSCs的治疗策略

由于中央髓核细胞可表达免疫赦免分子FasL，所以MSCs亦可表达FasL。因此，治疗IDD不仅可通过MSCs向中央髓核细胞方向分化并增添细胞数量，还可通过MSCs表达FasL增强或恢复中央髓核的免疫赦免功能和营养作用[7]。

如果MSCs未分化前即移植，则MSCs需在体内局部因素刺激下进行分化，这种方法虽然可使MSCs表型趋于稳定[23]，但可能导致谱系细胞恶性增殖。体外分化后移植可以确保MSCs定向谱系增殖，加强MSCs的特异性，但这种方法可能会影响其免疫抑制的潜力[24]，而且持久的体外分化可能涉及更大的风险和经济成本。虽然人骨髓被认为是MSCs最丰富的来源，但由于MSCs数量有限（占总骨髓分离的0.%~0.01%），使MSCs体内分化生存概率较低[3]。体外分化可提供足够的细胞数（1×/kg），这样既不失去MSCs的原有特性，还可通过组织工程学检测MSCs的形态、细胞表型标记物、细胞遗传学稳定性及其免疫特性，以判断其多向分化的潜能[3]。另外，MSCs在体外培7d后产生类似于天然透明软骨的表型细胞，与成骨细胞结合，可形成一种双层低聚的水凝胶复合物，并且个别软骨和成骨细胞表型可在体外维持28d[25]。

（三）MSCs的有效分化

MSCs软骨分化需上调特异基因并抑制MSCs可塑性的相关基因。目前，研究主要集中在MSCs有效诱导分化成骨-软骨细胞谱系。研究表明，三维培养体系和含转化生长因子β（transforminggrowthfactor，TGF-β）及地塞米松的无血清培养基是MSCs向软骨分化的基本条件，骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticproteins,BMPs）能提高TGF-β3介导的软骨分化，但单一使用效果并不理想[3,26]；在共培养体系下软骨细胞在促进骨髓干细胞向软骨分化中起诱导作用[27]。骨髓干细胞和软骨细胞混合培养能提高组织工程软骨的质量，其中以骨髓干细胞和软骨细胞的浓度比1∶2为最佳[28]。另外，不同供体的MSCs在相同诱导条件下可呈现不同层面的异向分化，但去除表观遗传调控的化学标记物，如DNA甲基或乙酰基团、特定基因激活和抑制的组蛋白，可能会解除这种现象[3]。研究表明，DNA甲基化是决定遗传调控基因转录活性的先决条件[29]。这可能是MSCs定向分化的决定因素。在体外诱导分化期间，人滑膜MSCs中的软骨细胞特定基因中富含CpG启动子，可抑制DNA甲基化作用，表观遗传调控机制可通过MSCs的软骨样分化来认知，并且复杂的表观遗传学可进一步理解不同供者MSCs的异向分化[30]。目前，由于在该领域中的研究尚浅，故还需更深层次地探究。

三、MSCs与椎间盘再生的体内及体外实验

（一）体外MSCs的软骨分化

从椎间盘内部本身存在的祖细胞（具有分化能力）、应用MSCs组织工程、椎间盘细胞的分子表型以及椎间盘内部的微环境等方面全面考虑体外MSCs的软骨分化[31]，利用三维共培养、细胞因子调控、基因导入等培养技术使MSCs在体外可被诱导分化为软骨样细胞或椎间盘样细胞。

在体外将大鼠骨髓干细胞和椎间盘细胞、椎间盘组织进行微团培养或间接共培养，可通过转孔膜系统分化为中央髓核样细胞，虽然骨髓干细胞与椎间盘组织之间被转孔膜相隔离，但通过胞质突起的细胞-细胞或细胞-组织相互作用可定向软骨分化（图4），Wei等[15]认为椎间盘组织和MSCs可以相互兼容，椎间盘组织有效影响MSCs的分化，同时椎间盘组织为MSCs分化提供有效的可溶性信号分子。Arkesteijn等[32]研究表明，犬脊索细胞（notochordalcells，NCs）无再生潜能，但是在低氧和高渗透压条件下，犬脊索细胞和MSCs在藻酸盐珠中共培养28d后发现，髓核细胞数量逐渐增加。另外，脐带血衍生的MSCs（人脐血MSCs）或嗅觉MSCs在体外共培养同样达到以上效果[33]。研究显示，即使骨髓干细胞与IDD内中央髓核细胞共培养，同样诱发胶原蛋白和蛋白聚糖数量的增加[34]。

图4共培养实验过程和MSCs与正常椎间盘组织共培后的超微观结构　A　共培养实验过程示意图，即将人类骨髓衍生的CD34（-）（非造血祖细胞，包括间质干细胞）分离并荧光标记，注射到大鼠尾骨椎间盘中，通过组织学和免疫技术进行筛查、提取，在体外将提取的MSCs和正常椎间盘组织进行微团培养或间接共培养，分析椎间盘组织与MSCs的兼容性　B,C　MSCs与正常椎间盘组织共培养14d后，扫描电子显微镜示共培养后的MSCs大部分呈球形或不规则状，少部分可通过转孔膜向相邻椎间盘细胞延伸，B为放大倍，C为放大倍

生长因子，包括TGF-βs、胰岛素样生长因子-1(insulinlikegrowthfactor-1,IGF-1）、成纤维细胞生长因子-2（fibroblastgrowthfactor-2，FGF-2）和BMPs可诱导MSCs向软骨分化[35]。甚至在低氧条件下，MSCs受到TGF-β1、TGF-β3等刺激后同样向软骨分化[26]。除TGF-βs外，生长和分化因子-5（growthanddifferentiationfactor5，GDF5）也有刺激MSCs向软骨分化的潜能[36]。在藻酸盐珠内培养时BMP-2和TGF-β3可诱导人骨髓干细胞向软骨分化[26]，但与单独生长因子相比，微团培养中藻酸盐珠的优势更明显[37]。Kim和Im[38]认为，TGF-β2和BMP-7联合应用诱导脂肪组织干细胞向软骨分化可能是目前最有效的培养基。Krock等[39]从MSCs与IDD内部的炎症微环境相互作用的角度研究发现，炎症因子可负向影响MSCs分化，而MSCs具有潜在的抗炎效应，这提出了MSCs移植前应进行预处理的重要性，让人耳目一新。

引导MSCs向特定中央髓核样细胞分化可通过遗传基因调控来实现。SOX9为软骨细胞谱系分化的重要转录因子，在胚胎发育期间，对脊索细胞的维护和正常脊柱的形成起重要作用[40]。在小鼠模型体内，骨髓干细胞采用过表达腺病毒来介导SOX9表达[41]，尤其在软骨细胞的基因和蛋白质内表达更为明显，促使骨髓干细胞向软骨分化。在低氧环境的培养基中，骨髓干细胞基因与慢病毒介导的抗细胞凋亡GFP-Bcl-2基因共同修饰，通过TGF-β1刺激可促进骨髓干细胞定向软骨分化[42]。这些研究为椎间盘再生所需的遗传基因标记和基因调控提供重要的信息。然而，考虑到医学伦理和安全性，涉及到基因导入的临床研究目前仍有限制。

（二）体内MSCs对IDD的修复

MSCs对椎间盘再生的应用目前只在多种动物模型中通过同种异体、自体或异种移植进行研究[15]。MSCs与生物材料支架和细胞因子等共同植入椎间盘内，通过产生新的椎间盘基质来复育和修复受损细胞[18]（图5）。移植细胞的存活率是确保椎间盘再生的关键因素。研究显示，植入的MSCs在健康的椎间盘微环境中能存活6个月，并且有分化成中央髓核样细胞的潜能[43]。骨髓干细胞移植到受损椎间盘后能继续生存和增殖，并且存活细胞向中央髓核细胞表型分化，形成相应的ECM，恢复局部椎间盘高度和水合状态[16]。脂肪组织干细胞与透明质酸支架共同移植到受损椎间盘后可增加基质蛋白，促进水化，移植8周后椎间盘含水量（在矢状面MRIT2WI）明显改善[44]。人MSCs异种移植到成年鼠、猪或兔的椎间盘后不产生免疫排斥反应[15,45]。人骨髓CD34细胞移植到成年鼠椎间盘后可存活多达6周，3周后Ⅱ型胶原蛋白表达增强，蛋白聚糖聚集[15]，植入的MSCs向软骨分化，表明CD34骨髓干细胞是修复IDD的潜在来源[15]。值得注意的是，存活的异种细胞中Fas-L蛋白表达水平较高，可能是一种免疫抑制因子[15]。异种MSCs的成功移植也反映椎间盘的免疫豁免特性和MSCs的免疫抑制性质[46]。

图5MSCs治疗椎间盘组织再生的主要步骤，MSCs可以直接扩增和分离，或与生物相容的支架（如水凝胶）组合，然后共同植入退变椎间盘组织中，通过产生新的椎间盘基质来复育和修复受损细胞，使椎间盘组织再生

另外，支架充当载体保护的作用，防止MSCs渗漏到其他组织，支持机械载荷的传导，在靶细胞递送、定位、分化、生长、复制及细胞代谢中发挥重要作用，并持续具有存活力，MSCs掺入到生物材料支架后移植可增加细胞存活率，促进移植MSCs增殖和分化。因此，无免疫原性、可生物降解及组织相容的生物材料支架是提高移植MSCs生存率的可靠保障，并能承受椎间盘机械加载的微环境[47]。研究表明，热可逆或易受酶促降解的聚合物支架可能是退变椎间盘再生的理想支架[48]。

四、MSCs与椎间盘再生的临床研究

在临床研究中，MSCs移植治疗IDD已显示出令人振奋的结果。Yoshikawa等[49]将自体骨髓干细胞移植到退化椎间盘来治疗2例腰痛和腿痛的IDD患者，移植2年后显示椎间盘真空现象（通过腰椎X线检测椎间盘内积聚的气体）减少，疼痛相关症状缓解，且2例患者椎间盘的含水量（在矢状面MRIT2WI）均明显增加，但椎间盘高度并无明显改善。Orozco等[17]将自体骨髓干细胞体外扩增后注入退化椎间盘中治疗10例伴随慢性腰痛的IDD患者（年龄35±7岁），1年后调查发现，其中9例（9/10）患者腰痛明显缓解，椎间盘水化明显改善，认为MSCs疗法可能是治疗IDD源性腰痛的有效替代治疗，但是椎间盘高度仍无明显改善。在美国，最近由多中心FDA批准的临床试验[]，单次注射（为期3年）骨髓干细胞载入人类透明质酸支架的复合体来治疗例IDD患者，其结果值得期待。基于临床研究的初级阶段表明，MSCs疗法在临床上使用安全，并且可有效缓解腰痛。但是MSCs在退变椎间盘中是否长期安全并持续存在，仍需要深入研究。

虽然在再生医学中MSCs治疗的潜力很大，但仍有许多问题值得探究。如何改变退变椎间盘酸性微环境对脂肪组织干细胞和骨髓干细胞增殖和存活能力的抑制作用[50]；如何获得足够的MSCs数量且保持其原有的特性，如何确定标准化的MSCs分离、扩增和鉴定方法，如何确定扩增的最佳培养基和条件以确保最佳效益，如何检测MSCs治疗IDD的长期安全性和有效性对其潜力的挖掘至关重要。此外，椎间盘独特的解剖学和生物学特性、IDD修复过程中的分子机制及相互作用、MSCs替代治疗的作用机制及是否与动物模型体内外实验一致尚不清楚，亟待深入探究。目前，基于MSCs治疗来修复IDD的研究仍建立在MSCs的有效分化以及如何精确表达中央髓核细胞表型和有效分化成软骨细胞的过程中。Gantenbein等[51]研究发现，三维体外人椎间盘整体培养生物反应体系可作为判定MSCs治疗IDD的可靠选择，可替代目前使用的动物模型研究，为人体临床试验开辟新的思路。Li等[52]从新近发现的椎间盘内的祖细胞及MSCs微环境的角度提出IDD内源性修复理论及助推内源性修复策略，为椎间盘再生开启新的捷径。

目前，MSCs治疗椎间盘再生的研究已取得显著进步。MSCs在体外能有效分化成软骨样细胞；在动物模型体内MSCs移植后存在退变椎间盘再生的潜力；并且MSCs注入中央髓核后形成透明软骨，而不是凝胶状基质[53]，MSCs向中央髓核细胞分化是椎间盘有效修复必不可少的条件。总之，MSCs治疗椎间盘再生的未来一片光明。虽然目前临床研究涉及的样本量小，但是MSCs治疗IDD源性腰痛的初期临床研究为椎间盘再生提供了积极的信号，为未来临床研究打下良好的基础。

参考文献略

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