间充质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤

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缺氧缺血性脑损伤(hypoxie·ischaemiebraininjury，HIBI)是导致新生儿死亡和儿童神经功能障碍的主要原因，目前临床尚无有效的治疗方法。间充质干细胞(mesenchymalstemceUs，MSC)移植治疗为减少缺氧缺血性脑损害带来了希望。

缺氧缺血性脑损伤(hypoxie·ischaemiebraininjury，)是一种弥漫性、进行性的神经元坏死和．HIBI神经元程序性死亡，是导致脑性瘫痪、智力落后和癫痫的主要原因。目前多采用高压氧、神经营养药物、细胞因子、中药及针灸等方法治疗，以抑制脑细胞凋亡和促进神经功能恢复为主，但对已经坏死的细胞所造成的功能障碍难以恢复。神经干细胞(neuralstemcell，NSC)移植治疗新生儿HIBI，由于其取材不方便、来源有限，发生免疫排斥的可能性较大，且人源性NSC移植涉及的伦理学问题成为其临床应用难以突破的最大障碍。间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)是一类具有自我增殖和分化潜能的多能干细胞，最早从骨髓中发现，随研究的深入，人们相继从脐血、胎盘、外周血、肌肉、血管、脂肪、皮肤等组织中也培养出MSC。目前对胚胎干细胞、骨髓MSC(BM．MSC)、脐血MSC移植研究较多，近年来也有报道人羊膜间充质细胞(humanamnionmesenchymalcells。hAMC)的相关研究oI-2]。MSC易获取和诱导分化，无成瘤性和免疫排斥反应发生，可以通过新生动物的血脑屏障，而且新生儿处于脑发育的特殊阶段，神经元和轴突生长旺盛，这些发育特点决定了新生儿期是接受MSC移植治疗的适宜年龄。

1MSC的细胞替代作用

1．1神经生物学特性BM．MSC体外培养表达神经元性标志物如神经元特异性核蛋白(NeuN)或胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，并伴有明显的形态学改变，无血清培养基的BM．MSC主要分化成神经元样细胞而表达NeuN，与胎鼠脑星形胶质共培养的BM-MSC分化成GFAP阳性细胞口J。体外培养hAMC表达MSC标记蛋白STRO-1和波形蛋白，以及神经干细胞标记蛋白巢蛋白和多唾液酸神经细胞黏附分子；表达神经元标记蛋白B微管蛋白Ⅲ、酪氨酸羟化酶和神经发生相关蛋白Math一1、Mash．1。巢蛋白是Ⅳ型中间丝蛋白，主要在神经干细胞一过性表达。多唾液酸神经细胞黏附分子是细胞表面的一种糖蛋白，参与中枢神经发育和可塑性的许多过程，介导细胞的黏附识别，是NSC、神经前体细胞可塑性的重要调节因子，其表达水平对NSC迁移、轴突生长和功能诱导非常重要。

1．2MSC移植后的迁移、增殖和分化MSC移植效应主要体现在存活、分化、定向迁移及改善神经功能受损等。Kim等H1应用MRI在大鼠体内示踪菲立磁标记的MSC，发现移植的细胞可存活10周，并显示亲灶性。MSC分化为神经细胞属于跨胚层的横向分化形式，分化率远低于NSC的定向分化率，经BrdU标记的MSC移植入脑后只有1％一5％分化为神经细胞，并且BM—MSC脑移植后分化的细胞形态为球形，突起少，与其他神经细胞建立突触联系可能比较困难Ko。这说明MSC移植后直接的细胞替代作用可能是有限的。而发现即使移植的NSC只分化出个神经细胞核抗原阳性细胞，也能改善脑缺血大鼠的行为学评分，说明MSC新分化的神经细胞也许更有利于形成有效的突触联系。Guan等orj通过对HIE组和正常对照组新生大鼠腹腔注射BrdU标记的MSC，14d后检测进入脑组织的移植细胞及其分化抗原的表达，发现MSC广泛分布于大脑组织，HIE组BrdU标记的MSC多于对照组；HIE组缺血侧大脑半球的MSC多于未缺血侧；MSC可以透过新生大鼠血脑屏障进入脑实质，并更多地向脑损伤部位迁移聚集；但是14d内定植于脑实质的MSC未分化为神经元和星形胶质。朱美玲等L8o应用MSC移植治疗HIBI新生鼠时发现移植治疗组第一周成活率明显高于对照组，水迷宫实验显示MSC移植组的空间识别和记忆能力优于对照组，移植组在进针注射部位存在大量移植细胞，并向周围迁移，皮质层、海马等部位检测到移植细胞；所植入的细胞约6％表达胶质纤维酸性蛋自，约8％表达神经元特异性烯醇化酶。国外学者对HIBI大鼠行MSC移植，21d后发现可减少缺氧缺血所致的42％神经元和31％少突胶质死亡，缺血侧大脑半球BrdU标记的MSC显著增多；制模后10d和21d移植组大鼠神经功能较对照组明显改善。

2神经营养因子分泌作用

MSC可以分泌多种细胞因子以调节细胞的增殖分化，这些细胞因子包括IL-6、7、8、1l、干细胞因子、神经生长因子(NGF)、促红细胞生成素、白血病抑制因子(LIF)、转化生长因子．B、集落刺激因子．1(CSF—1)、脑源性神经生长因子(BDNF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等。神经营养因子治疗新生儿HIBI的机制为调节神经细胞代谢，保持细胞最佳生理状态，促进神经细胞分化，诱导轴突生长，促进神经细胞产生神经递质及提高贮存神经递质的能力，促进微血管形成，改善神经功能。有学者发现，MSC移植可能通过促进脑内bFGF的合成和分泌，改善HIBI新生大鼠神经功能归。在MSC移植治疗中，神经营养因子的作用可能要比细胞替代作用占有更重要的地位。

2．1促进内源性NSC的增殖及分化不论是发育中的脑还是成年脑中都发现了内源性NSC。新生儿期室管膜下区存在较丰富NSC，缺氧缺血性脑损伤时，由于细胞微环境的改变，内源性NSC被激活，启动自发修复反应。内源性NSC的存活、增殖和分化受多种细胞因子的调控，如BDNF、bFGF、IL、转化生长因子等。Borlongan等¨刮发现BM—MSC移植能促进卒中大鼠内源性NSC的增殖，因此MSC移植可以通过增强内源性NSC的修复作用而减轻HIBI。

2．2促进轴突再生及再髓鞘化HIBI后，如果神经细胞轴突得不到有效保护，细胞核周体就会失去功能；少突胶质得不到有效保护，其损伤导致的脱髓鞘病变可使轴突出现严重功能障碍。缺血性脑损伤的修复不仅是神经细胞的修复，轴突和髓鞘对于功能重建也起到重要的作用。MSC可以直接分化为少突胶质；另外，轴突的再生、少突胶质的增殖、存活和分化同样受到多种细胞因子的调控，其中IL石和LIF能促进少突胶质的成熟与髓鞘化¨1

。新生动物脑组织处于快速发育期，神经元增殖和轴突生长旺盛，含有较成年动物更多的NSC；新生动物中枢神经系统发育的特点决定其脑组织具有利于MSC移植后增殖、分化、迁移与整合的微环境和轴索延伸生长的纤维通路。

3促进新生血管形成

多数观点认为，MSC的分化方向与微环境密切相关，如果将MSC处于向血管内皮细胞(VEC)分化的微环境中，MSC的某些特征性血管内皮细胞基因开放并可能表达相关蛋白，从而使其分化为VEC。VEGF是MSC分化为VEC的重要条件，可以促进MSC分化的同时上调VEGFR-2和VEGFR一1的表达，而这两种因子在体内血管再生以及体外促进基质金属蛋白酶形成毛细血管样结构的过程中发挥重要作用。脑缺氧缺血后，神经再生、神经功能的恢复与缺血部位新血管的形成及重塑密切相关。低氧可以作为一种信号激活VEGF／VEGFR系统，加速血管内皮细胞增生。新生大鼠HIBI脑胼胝体中VEGF、低氧诱导转录因子．1d、内皮型NO的表达增加¨2‘。有学者发现MSC能促进大鼠脑内血管发生，可能与促进星形胶质及VEC分泌VEGF有关¨“”1。脑梗死24h后的大鼠通过颈内动脉注射MSC后28d发现大鼠神经功能评分明显改善，免疫组织化学检测发现梗死区周围新生血管周径和密度增高引。提示MSC移植后参与脑血管重建，诱导血管再生，改善局部血液循环。

4免疫调节作用

有学者发现MSC可以通过下调Caspase-3而抑制脊髓损伤处神经元和少突胶质凋亡，从而发挥神经修复功能¨6。在促进新生鼠学习记忆功能重建中，BM—MSC的植入起一定作用，视黄酸诱导的BM．MSC可能通过调节HIBI大鼠脑内IL-6、Fas等因子保持适宜水平而发挥作用，MSC对炎症反应的调节可能是MSC促进脑损伤修复的重要机制¨7。

5热点及展望

MSC不仅有多向分化潜能，还能够转染和表达外源性基因，是理想的基因载体细胞，从而将细胞移植与基因治疗相结合。目前主要通过病毒和质粒转染使MSC定向分化为神经细胞，并使神经营养因子或细胞因子高表达，改善细胞微环境，有利于细胞移植后修复受损脑组织，改善神经功能¨。

MSC向神经细胞分化的潜能及移植后对新生动物HIBI的功能改善已逐渐得到认可，为探索新生儿HIBI的治疗提供了新的途径。但还存在一些问题有待解决：如何选择MSC移植的时间；移植后改善宿主神经功能的机制尚不十分明确，其分化的表达神经组织标志的细胞是否具有神经细胞功能，能否建立突触联系等。随着MSC在分子生物学、发育生物学等领域研究的深入，MSC移植为减少HIBI造成的残障率、改善儿童生活质量带来了希望。